樣品制備質量直接影響顯微鏡成像效果，但固定失效、切片褶皺、染色不均等問題頻發。本文系統梳理10大典型問題，結合顯微圖像案例，提供可落地的解決方案。

一、固定失效：組織自溶與抗原流失

問題表現：細胞形態模糊、結構松散
解決方案：

固定液選擇：

常規組織：4%多聚甲醛（4℃保存）

膜蛋白保護：添加0.1% Triton X-100

固定時間：

薄切片（<1mm）：2-4小時

整塊組織：12-24小時（需真空滲透）

驗證方法：

切片后行H&E預染色，觀察核質分界清晰度

二、切片問題：厚薄不均/褶皺/破裂

問題表現：切片卷曲、厚度超標（>5μm）
解決方案：

刀片維護：

玻璃刀：用酒精燈灼燒去除組織殘渣

一次性刀片：每20次更換新刀片

防卷板技巧：

調整防卷板角度至15-20°

涂抹薄層甘油（降低靜電吸附）

切片方向：

纖維組織：平行于纖維走向切片

血管組織：垂直于血流方向切片

三、染色不當：對比度不足/過染

問題表現：細胞核染色過淺/細胞質染色溢出
解決方案：

蘇木素染色：

初染時間：3-5分鐘（室溫）

分化液控制：鹽酸酒精分化至粉紅色即止

伊紅染色：

濃度選擇：0.5-1%伊紅Y水溶液

染色時間：1-3秒（鏡下觀察控制）

特殊染色：

脂質染色：蘇丹Ⅲ需用70%酒精分化

黏液染色：阿爾辛藍需pH2.5環境

四、脫水不徹底：封片后產生氣泡

問題表現：切片出現彩虹狀氣泡
解決方案：

梯度脫水：

酒精梯度：70%→80%→95%→****（每級5分鐘）

叔丁醇替代：用于對酒精敏感樣本

干燥驗證：

二甲苯透明后，用濾紙測試無濕潤痕跡

封片技巧：

中性樹膠需預熱至40℃（降低黏度）

蓋玻片傾斜45°緩慢放下

五、樣品污染：真菌/細菌滋生

問題表現：切片出現絮狀沉淀物
解決方案：

預防措施：

固定液添加0.01%疊氮化鈉

切片刀用75%酒精擦拭消毒

應急處理：

污染切片：重新脫水至70%酒精后浸泡于1%氫氧化鈉24小時

嚴重污染樣本：廢棄處理并消毒器械

結語
樣品制備是顯微鏡觀察的基礎環節，需建立標準化操作流程（SOP），關鍵步驟設置質量控制點。建議每月進行制備成功率統計，定期參加技術培訓班。掌握這些核心技能，您將顯著提升制片合格率與成像質量。