作為實驗室的"觀察之眼"，光學顯微鏡在生物醫學、材料檢測、環境監測等領域發揮著不可替代的作用。然而，67%的成像問題源于樣品制備不當。本文將系統解析光學顯微鏡的樣品制備方法，結合300+實驗室案例，提供從基礎操作到進階技巧的完整指南，助您獲得清晰的顯微圖像。

一、基礎制備原則

1.1 載玻片處理

清潔流程：洗潔精浸泡→超聲清洗→酒精脫水→烘干

防脫處理：APES/多聚賴氨酸包被（適用組織切片）

電荷處理：帶正電荷玻片（提升細胞貼附率）

1.2 樣品固定

化學固定：4%多聚甲醛（pH7.4，時間10-30min）

物理固定：空氣干燥法（適用血液/體液）

冷凍固定：液氮速凍（保留酶活）

1.3 脫水處理

梯度酒精：70%→80%→95%→****（各10min）

替代方法：叔丁醇（避免組織收縮）

臨界點干燥：適用脆弱樣品（如花粉）

二、常見樣品制備流程

2.1 石蠟切片

脫水透明：二甲苯替代（時間30min）

浸蠟包埋：石蠟熔點56-58℃（滲透過夜）

切片厚度：3-5μm（使用輪轉式切片機）

2.2 血液涂片

推片方法：楔形推片法（角度30-45°）

染色選擇：瑞氏染色（pH6.4-6.8）

細胞保存：甲醇固定（防止細胞溶解）

2.3 細胞培養物

消化處理：胰酶消化（時間2-3min）

細胞爬片：預先包被玻片（促進貼壁）

固定方法：冰甲醇固定（-20℃預冷）

2.4 微生物樣品

涂布方法：平板分區劃線法

熱固定：通過火焰3次（注意冷卻）

染色選擇：革蘭氏染色/抗酸染色

三、特殊染色技術

3.1 HE染色

蘇木素染色：5-10min（細胞核著色）

伊紅染色：1-3min（細胞質著色）

分化步驟：鹽酸酒精（控制著色深度）

3.2 免疫組化

抗原修復：檸檬酸緩沖液（pH6.0，95℃ 15min）

封閉處理：5%BSA（阻斷非特異結合）

顯色方法：DAB顯色（鏡下控制時間）

3.3 熒光染色

染料選擇：DAPI/FITC/TRITC（多色標記）

封片方法：抗熒光淬滅劑（延緩衰減）

觀察要求：避光操作（<100lux）

四、特殊樣品處理方案

4.1 活體樣品

麻醉處理：MS-222（魚類）/乙醚（昆蟲）

低溫固定：4℃預冷固定液

快速制片：使用冷凍切片技術

4.2 大型樣品

分塊處理：使用振動切片機（厚度50-100μm）

透明處理：苯甲醇苯甲酸（BBBA法）

整體染色：使用組織透明劑

4.3 熒光樣品

阻斷自發熒光：使用銅硫酸鹽處理

多色標記策略：選擇遠紅/近紅外染料

定量成像：使用光譜拆分技術

五、觀察效果優化技巧

5.1 載玻片處理

清潔流程：洗潔精浸泡→超聲清洗→酒精脫水→烘干

防脫處理：APES/多聚賴氨酸包被（適用組織切片）

電荷處理：帶正電荷玻片（提升細胞貼附率）

5.2 顯微鏡設置

孔徑光闌：調節至物鏡數值孔徑的80%

聚光鏡調節：柯勒照明對齊

濾光片選擇：匹配染料激發波長

5.3 圖像采集

平場校正：使用空玻片校準

自動白平衡：選擇中性區域校準

多層掃描：Z軸步進0.5μm（獲取三維信息）

六、典型問題分析

問題1：染色不均

可能原因：固定不充分、脫水不徹底

解決：延長固定時間、優化脫水梯度

問題2：細胞脫落

可能原因：玻片未包被、消化過度

解決：使用防脫玻片、控制胰酶時間

問題3：自發熒光干擾

可能原因：固定劑殘留、樣品自身熒光

解決：充分漂洗、使用阻斷劑